James Stewart est né le 20 mai 1908 à Indiana, en Pennsylvanie où son père tenait une quincaillerie. Il fait des études d’architecture à l'université de Princeton et s'intéresse particulièrement au théâtre. Après son diplôme, il rejoint à Falmouth, dans le Massachusetts, un de ses anciens camarades, Joshua Logan (le futur réalisateur de Picnic et d’Arrêt d’autobus) qui vient de créer une compagnie théâtrale, « les University Players ». Henry Fonda et Margaret Sullavan font partie de cette troupe. James Stewart joue à Broadway plusieurs petits rôles. Hedda Hopper, qui joue avec lui " Divided by three", parle de lui à Bill Grady, un des « dénicheurs d’acteurs » de la Metro-Goldwyn-Mayer. James Stewart a 27 ans et se voit proposer un contrat de sept ans. Son premier rôle il le tient aux côtés de Spencer Tracy dans The Murder Man (1935, Tim Whelan).
C'est le film L’Amiral mène la danse (1936, Roy Del Ruth) qu'il se fait remarquer des amateurs de cinéma. En dansant et en chantant, il connaît son premier succès cinématographique. Frank Capra le repère et l’engage pour Vous ne l’emporterez pas avec vous (1938). Leur second film, Mr. Smith au Sénat (1939) permet à Stewart d'obtenir une première nomination aux Oscar. L'année suivante, il remporte l'Oscar de meilleur acteur pour son interprétation d'un chroniqueur dans Indiscrétions (1940, George Cukor). Alors au sommet de la gloire, il surprend la MGM en se portant volontaire pour la Deuxième Guerre. Il est la première vedette hollywoodienne à donner ainsi l'exemple et exige d'être traité comme un simple soldat. Il prend part à 25 missions en tant que pilote de bombardier au-dessus de l'Allemagne, est bientôt nommé colonel et reçoit la Croix de guerre du gouvernement français en 1945. Il revient aux États-Unis en septembre de cette même année tout auréolé de sa gloire militaire et se retrouve à Hollywood où Frank Capra lui offre le rôle de Georges Bailey dans La vie est belle (1946). Son interprétation lui vaut une troisième nomination aux Oscars. C’est aussi sa dernière collaboration avec Capra. À l'âge de 41 ans, il abandonne la vie de célibataire et épouse Gloria Hatrick McLean le 9 août 1949. Le couple aura en mai 1951 deux jumelles, Judy et Kelly.
James Stewart devient l'un des premiers à ébranler la structure des grands studios en exigeant une part des profits que rapportent les films dans lesquels il joue. Son premier film "à profits partagés" est Wincester 73 (1950) qui l'établit comme une star du western et marque le début de sa fructueuse association avec le réalisateur Anthony Mann. Ils feront sept autres films ensemble (dont quatre grands westerns) : Les Affameurs (1952), L’Appât (1953), Le port des passions (1953), Romance inachevée (1954), Je suis un aventurier (1955), Strategic Air Command (1955), L’Homme de la plaine (1955).
En quelques années, James Stewart prouve toute l’étendue de son talent, l’élégant et discret camarade, amoureux transi, plutôt timide des comédies de Capra a fait place à l’ombrageux cow-boy vengeur, égoïste et souvent maltraité des westerns manniens. Mais il est aussi un hilarant clochard à l'imagination débordante (qui lui vaudra une nouvelle nomination aux Oscars) dans Harvey (1950, Henry Koster), un clown inquiétant dans Sous le plus grand chapiteau du monde (1952, Cecil B. DeMille), Charles A. Lindbergh dans L’Odyssée de Charles Lindbergh (1957, Billy Wilder). Son rôle de l’avocat dans Autopsie d’un meurtre (1959, Otto Preminger) lui apporte une cinquième et dernière nomination aux Oscar.
Hitchcock discerne parfaitement en lui toute une part de mystère qu’il distille avec génie dans La Corde (1948), Fenêtre sur cour (1954), L’Homme qui en savait trop (1956) et Sueurs froides (1958). Ces quatre rôles l'immortalisent auprès des cinéphiles.
James Stewart, l’Américain idéal et vénéré, ne se trompait pas : "J'ai eu l'habitude de choisir des rôles de gars vulnérables, le mec qui fait des erreurs, celui qui ne peut pas se figurer toutes les conséquences de ses actes, mais qui garde le contrôle."
Les années soixantes marque un ralentissement dans sa carrière mais s’il tourne moins, ses interprétations sont toujours aussi fortes en particulier dans les trois derniers sublimes westerns de John Ford : Les deux cavaliers (1961), L’Homme qui tua Liberty Valance (1962) et Les Cheyennes (1964). Il est aussi remarquable en patriarche vengeur dans Les Prairies de l’honneur (1965, Andrew V. McLaglen).
En 1970, James Stewart retourne au théâtre pour y jouer " Harvey " et l'année suivante, il se résout à faire de la télévision. Son émission " The Jimmy Stewart Show " est un joli succès et en 1972, il devient le héros d'une série de télévision " Hawkins on Murder" et obtient l’année suivante un Golden Globe pour son interprétation. Depuis 1970, l'activité cinématographique de James Stewart s'est ralentie mais l'un de ses derniers films, Le dernier des géants lui permettait de retrouver son vieux complice de l’Ouest, John Wayne.
Dans les années 80-90, il fut honoré par les plus grands associations : l'American Film Institute (1980), The Kennedy Center (1983), l'Academie of Motion Pictures Arts ans Sciences (1985), Film Society of Lincoln Center (1990), la Médaille de la Liberté (1985) et sa ville natale a érigé une statue à son image (1983).
Son épouse Gloria, avec lui depuis 45 ans, décède en 1994, lui, s’éteint le 2 juillet 1997. Bill Clinton alors Président des Etats Unis déclare que "L'Amérique a perdu aujourd'hui un trésor national". L'un des derniers rescapés de l'Hollywood des années 50, Charlton Heston, salue à la fois l'acteur et l'homme: "Il était profondément patriote, profondément professionnel, un acteur de talent. Et peut-être plus important encore, c'était un gentleman."