Ressoures scientifiques
STAGE D'IMMUNOLOGIE

Formation continuée NANCY-METZ 1998

Pr BENE, Pr FAURE - Laboratoire d’immunologie

Faculté de Médecine - BP 184

54500 VANDOEUVRE-LES-NANCY
 
 

PARTIE 2 :

LES TECHNIQUES UTILISEES EN IMMUNOLOGIE






4. LES PRINCIPALES TECHNIQUES D'IMMUNOPRECIPITATION

41. Notion de courbe de précipitation

A un tube contenant une quantité constante d'anticorps, on ajoute progressivement des antigènes. Qu’observe-t-on à mesure que la concentration en antigènes augmente ?

1 - au départ, il ne se passe rien (effet zone) : pas de ponts entre les Ag par excès d'anticorps (cette étape parfois assez longue peut être prise pour un résultat faussement négatif : patience !) ;

2 - puis apparaît un trouble, un précipité : zone d’équilibre entre Ag et anticorps formant réseau moléculaire responsable de l’agglutination ;

3 - enfin ce trouble disparaît : dissociation du réseau par excès d'Ag.

Ces interactions peuvent se traduire par une courbe de précipitation.

Corollaire pathologique :

  • les petits complexes immuns sont éliminés par les reins ;
  • les gros complexes immuns sont détruits par les macrophages ;
  • les complexes immuns intermédiaires entraînent l'activation du complément et des réactions inflammatoires (ex : Lupus Erythémateux Disséminé).
Corollaire technique : si on mesure la quantité de précipité, il faut savoir dans quelle partie de la courbe on se situe car on peut obtenir une même valeur de précipité pour des concentrations différentes en anticorps...
 
 
42. Précipitation en milieu liquide
421. Le ring-test ou test de l'anneau
Les deux phases (phase inférieure contenant l’anticorps et phase supérieure contenant l’antigène) ne sont pas mélangées. L’antigène descend lentement au contact de l’anticorps pour former un complexe Ac-Ag à la zone d’équilibre de la courbe de pércipitation (partie 2). La position de l'anneau indique la présence de l'Ag ou de l'Ac que l'on recherche.

Cet ancien test, surtout qualitatif, est un peu quantitatif par la position de l'anneau : plus il y a d'antigène, plus l'anneau est bas (exemple de la brucellose dans livre de TS).
 
 

422. Techniques de néphélémétrie ou de turbimétrie
Un rayon laser traverse le tube contenant d’éventuelles particules du précipité. La diffraction de la lumière par les particules (nephelos = nuage) est mesurée à la sortie. Plus il y a de précipité Ac/Ag, plus il y aura de signal sur le photomultiplicateur (appareil qui mesure la diffraction). La mesure, rapide et automatisée, permet un dosage quantitatif. Cette technique permet aussi des mesures d'agglutinats.

43. Précipitation en milieu solide
Le gel d'agarose (3% à 10%) utilisé retient les précipités dans ses mailles.
431- Technique d'Ouchterlony ou de double immunodiffusion
L'agarose est coulé sur une plaque de verre de quelques millimètres d'épaisseur. On y découpe deux puits à l’emporte-pièce : dans l’un des puits est placé un anticorps et dans l'autre puits est versé un antigène. Un précipité apparaît dans la zone d’équilibre.

Ce test est qualitatif et semi-quantitatif : l'arc se déplace selon les concentrations relatives pour se situer le plus près du puits où la concentration est la plus faible (dissolution hors des concentrations optimales).

Quand la réaction est terminée (24 à 48 h), on peut laver l'agarose dans du sérum physiologique sans altérer le complexe immun retenu par le maillage de l’agarose, puis colorer les protéines du complexe immun pour révéler la bande de précipité (zone grisée sur le schéma ci-dessous).




Lors de l’utilisation d’une série de puits disposés en couronne au tour d’un puits central, la lecture peut révéler :

  • une fusion des arcs, indiquant un même complexe immun ;
  • un éperon (arcs sécants), indiquant deux complexes immuns différents (les puits périphériques ne contiennent pas les mêmes antigènes) ;
  • des arcs doubles dans le cas de plusieurs antigènes dans les puits périphériques et de plusieurs anticorps dans le puits central.


432. Electrosynérèse
La migration est accélérée grâce à un courant électrique. Les anticorps chargés négativement sont attirés par la cathode, les antigènes sont attirés plutôt par l'anode. Les résultats se lisent en 3 à 4 heures par une immunoprécipitation située entre les deux puits.


423. Immunoélectrophorèse
Les étapes sont les suivantes :
  • une lame de microscope est recouverte d'agarose et percée de deux puits ;
  • on sépare des protéines grâce à un courant électrique (ex : électrophorèse de sérum humain) ;
  • on découpe ensuite une gouttière au milieu de la lame, dans laquelle on verse de l'anti-sérum polyclonal animal "anti-sérum humain" reconnaissant pratiquement toutes les protéines du sérum humain ;
  • après diffusion, on obtient différents arcs de précipitation qui peuvent être colorés et comparés.
La même chose peut être faite avec un seul anticorps.
 
 



 

424. Technique de Mancini
On utilise un gel d'agarose qui contient déjà un anticorps :
  • des puits sont percés dans lesquels on met l'antigène ;
  • l' antigène diffuse dans le gel, déplaçant la zone d'équilibre ;
  • après 48 heures les rayons des anneaux de précipitation, qui se sont progressivement éloignés du puits, sont mesurés car proportionnels à la quantité d'antigène.
On peut réaliser ainsi une courbe d'étalonnage et obtenir un résultat quantitatif.
 
 


425. Technique de Laurell
Une plaque d'agarose contient un anticorps réparti uniformément :
  • des puits sont percés dans lesquels on met l'antigène à différentes concentrations ;
  • l’antigène migre par application d’un courant électrique ;
  • des arcs de précipitation apparaissent déformés en "rockets" (fusées) par action du champ électrique ;
  • la hauteur des "rockets" est proportionnelle à la quantité d'Ag (même principe que pour Mancini) : ce résultat quantitatif s’obtient en 4 heures.
 
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